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本文標題："限制酶切割形成有交叉缺口之雙股DNA"

建構(gòu)重組DNA

    本實驗僅以均經(jīng)限制酶切割形成有交叉缺口之雙股DNA行之. 將嫁接媒介與所要構(gòu)建進入媒介的DNA適量溷合, 加入1μ的T4 DNA ligase, 再加入適量ligase buffer及適量BSA, 置25℃, 2hr, 此種建構(gòu)方式會產(chǎn)生因隨機結(jié)合的各種不同重組DNA, 亦有多于一段以上所要的DNA同時構(gòu)建入同一媒介者. 再以電泳分離之. 再將構(gòu)建好的媒介轉(zhuǎn)植入宿主細胞, 并使之增殖, 再將含重組DNA的細胞保存于甘油液中, 保存在-70℃.

    若欲檢測所要的DNA是否已進入某一宿主細胞中, 可將此宿主細菌以涂平盤法長在平盤上再以nylon濾紙蓋上, 將菌群模印在nylon濾紙上, 再將此濾紙以鉛筆做上正面(有菌群)之記號, 并以尖針在濾紙上刺四處小孔, 并與培養(yǎng)皿上的相對位置標好, 如：

    再將此nylon濾紙放在一張吸滿0.5M NaOH的濾紙(普通濾紙)上, 5min, 再將nylon濾紙在移放在另一張吸滿1M Tris. Cl, pH7.5的普通濾紙上, 5min, 再將nylon濾紙移放在另一張吸滿0.5M Tris. Cl, pH7.5/1.2M NaCl的普通濾紙上, 5min, 接下來將此nylon濾紙置已自動設(shè)定之UV Crosslinker中, 使DNA固定, 再進行南方式雜交, 以DNA探針找出所要DNA的菌群位置, 則可在原始培養(yǎng)皿上找出所要的菌群. 此nylon 濾紙可先以鋁箔紙包好高溫高壓消毒以達無菌狀態(tài). 在印取菌群時, 勿讓nylon濾紙與平盤間有空隙.