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本文標(biāo)題："了解溷濁度和活菌數(shù)目之間的關(guān)系"
溷濁度和活菌數(shù)的關(guān)系(Relationship between
Turbidity and Live bacteria)
目的：
1. 了解無(wú)菌操作的方式
2. 了解溷濁度和活菌數(shù)目之間的關(guān)系
3. 瞭解如何做稀釋
原理：
簡(jiǎn)介大腸桿菌(Escherchia coli)
大腸桿菌的品系(strains)
E. coli B/r (HB101) wild type
E. coli TOP10F’ F’{lacIq, Tn10(TetR)} mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC) ψ80lacZ△M15
△lacX74 deoR recA1 araD139 △(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)
菌種的純化( Strain purification)
1. Overnight culture (O/N) — 用接種環(huán)或藥匙經(jīng)消毒后，從甘油儲(chǔ)存菌種或LB平板
上取出（沾一下）菌，接種于3-5 ml的LB（含有適當(dāng)?shù)陌被峄蚴强股兀�，�?br />37 ℃下震盪培養(yǎng)隔夜（14-18 小時(shí)）。
2. Dilution buffer — 滅菌過(guò)的100 mM MgSO4
3. Isolation of single colonies — 剛拿到手的菌種或是從甘油儲(chǔ)存菌種要開(kāi)始作實(shí)驗(yàn)
前，菌種需先純化﹕用單一菌落﹔得到單一菌落的方法有二﹕（1）從O/N culture 用
100 mM MgSO4去做一連續(xù)的十倍稀釋，用接種環(huán)從高稀釋度開(kāi)始取出稀釋液，
涂抹在LB平板上﹔（2）用接種環(huán)沾取O/N culture或菌落涂抹在LB平板的一邊
（a），接種環(huán)經(jīng)消毒后，再?gòu)牡谝淮瓮磕ǖ牡胤桨丫磕ㄩ_(kāi)，以便得到單一菌
落（b1-b4）。若是新到手的菌種，在得到單一菌落后，先根據(jù)基因型去測(cè)試菌
種。
4. 菌種保存﹕glycerol (10%) or DMSO (7%) storage (at –70 ℃)
測(cè)量細(xì)菌的濃度 (cells/ml)
用溷濁度﹑細(xì)菌數(shù)目和活菌數(shù)目來(lái)測(cè)定。
溷濁度 — 其原理是可將細(xì)菌視為懸浮顆粒，這些顆粒可阻斷光線的通過(guò)，因此
細(xì)菌濃度愈高，通過(guò)的光線愈少，就等于吸光值愈大，然而我們不認(rèn)為它是吸
光值，只是細(xì)菌將光線散射掉了，因此我們用溷濁度表示﹔大多數(shù)時(shí)候我們是用
LB來(lái)培養(yǎng)E. coli，因?yàn)長(zhǎng)B的顏色是黃色，所以用分光光度計(jì)去測(cè)量細(xì)菌濃度時(shí)，
波長(zhǎng)選用600 nm﹔若是用minimal medium來(lái)培養(yǎng)E. coli，因?yàn)閙inimal medium的顏
色是無(wú)色，所以用分光光度計(jì)去測(cè)量細(xì)菌濃度時(shí)，波長(zhǎng)選用460 nm。用溷濁度來(lái)
測(cè)量細(xì)菌的濃度只是估計(jì)值，正確數(shù)目則需用下列方法決定之。
細(xì)菌數(shù)目— 使用Petroff-Hauser Chamber在顯微鏡下數(shù)細(xì)菌的數(shù)目，在這
Chamber內(nèi)約有100格，每格的體積為10 µl﹔在使用此Chamber需要將此玻片的兩面
清乾淨(jìng)，尤其不能有任何的纖維殘留，因?yàn)槔w維會(huì)將細(xì)菌和培養(yǎng)液分隔開(kāi)而造成
菌數(shù)分配不均，進(jìn)而影響精確度。蓋玻片是否確實(shí)蓋好也是影響精確度的重要因
子。
活菌數(shù)目— 上一項(xiàng)的方法將死和活的細(xì)菌數(shù)目均計(jì)算在內(nèi)，所以活的細(xì)菌數(shù)目是
用一連續(xù)的稀釋菌液后，取0.1 ml的稀釋液涂抹在LB平板上等菌落長(zhǎng)出后，數(shù)其
菌落數(shù)，即可推出每ml的活菌數(shù)目。
器材：
培養(yǎng)基(LB)
100 mM MgSO4溶液
37℃培養(yǎng)箱(incubator)
方法：
1. 向助教領(lǐng)取兩種（年輕和年老）的菌液，分別作1/2（年輕）和1/4（年老）的稀
釋，先用分光光度計(jì)以600 nm波長(zhǎng)去測(cè)量稀釋液的溷濁度，并紀(jì)錄其值。
2. 用此數(shù)據(jù)1 OD600= 1-3 X 108 cells/ml去推算約略所需要的稀釋度，以便在取用0.1
ml的稀釋液去涂抹在LB平板時(shí)，可得到菌落數(shù)為30-300個(gè)。
3. 稀釋菌液用10 mM MgSO4溶液。
4. 稀釋后用三種連續(xù)稀釋度，如10-1﹑10-2和10-3，取兩次0.1 ml的稀釋液分別去涂抹
在LB平板（共6個(gè)LB平板），等到LB平板上所有的液體不見(jiàn)后，將平板倒置并
放置于37 ℃培養(yǎng)箱，次日中午以前到助教處數(shù)菌落數(shù)。
5. 請(qǐng)討論為何從年輕和年老的菌液所得的菌數(shù)有差異，和前面的實(shí)驗(yàn)又有何關(guān)聯(lián)﹖
6. 請(qǐng)和實(shí)驗(yàn)一的數(shù)據(jù)作比較，提出一個(gè)假說(shuō)。用下星期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。
殺過(guò)菌的玻管
細(xì)菌展開(kāi)用的玻棒
培養(yǎng)基平板