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氨基酸的混合物測量記錄精密的儀器實驗設(shè)計
當(dāng)洗脫緩沖液的pH增大時,氨基酸上面的正電荷減少,直到氨基與
樹脂的結(jié)合減弱到可以被洗下時為止。每種氨基酸達到這一點的條件是
不同的,這取決于分子上其他可電離基團的性質(zhì),在非極性氨基酸的情
況下,甚至還取決于側(cè)鏈的性質(zhì)。因此利用在低pH時吸附氨基酸,然后
再慢慢提高洗脫劑的pH和離子強度,就能成功地做到重復(fù)性好而又輪廓
清楚地把所有氨基酸分開。在現(xiàn)代實際中,這種過程已全部自動化了。
為了容易分開,氨基酸的混合物被自動地放到一根至少含有二種類型樹
脂的柱上去。在洗脫緩沖液中,產(chǎn)生一種pH和離子強度的梯度,然后把
從柱底流出的氨基酸用比色測定法監(jiān)控,測得的結(jié)果接著就被記錄于記
錄紙上。在最精密的儀器中,比色數(shù)據(jù)可輸入到臺式計算機,計算機自
動計算各種氨基酸的量,以及該氨基酸在原來蛋白質(zhì)中的百分率,或更
通常是計算殘基數(shù)/1000殘基。
要測定一個蛋白質(zhì)的氨基酸順序,必須把蛋白質(zhì)斷成有限數(shù)量的較
小的肽單位。為了形成合理數(shù)量的肽以進行以后的分析,斷裂必須是專
一的和重復(fù)性好的。芳此常利用純化的蛋白酶,多半是胰蛋白酶、胰凝
乳蛋白酶和胃蛋白酶來裂解蛋白質(zhì)。用這些酶去水解蛋白質(zhì)只需極少量
就夠了,而且近年來已制成能把這些酶結(jié)合到不溶性的、不活潑的聚合
支持物上去的活性衍生物。使用這些不溶性的衍生物,酶就能用離心法
從水解溶液中回收并再次利用。
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